Ten zestaw służy do jakościowego wykrywania nowego koronawirusa (2019-nCoV) za pomocą wymazów z gardła, wymazów z jamy nosowo-gardłowej, płynu z popłuczyn oskrzelowo-pęcherzykowych, plwociny. Wynik wykrywania tego produktu służy wyłącznie do celów klinicznych i nie powinien być używany jako jedyny dowody na kliniczną diagnozę i leczenie. Zaleca się wszechstronną analizę stanu w połączeniu z objawami klinicznymi pacjenta i innymi badaniami laboratoryjnymi.
Zestaw oparty jest na technologii one-step RT-PCR.W rzeczywistości geny ORF1ab i N nowego koronawirusa 2019 (2019-nCoV) wybrano jako regiony docelowe amplifikacji.Specyficzne startery i sondy fluorescencyjne (sondy genu N są znakowane FAM, a sondy ORF1ab są znakowane HEX) są przeznaczone do wykrywania RNA koronawirusa nowego typu 2019 w próbkach.Zestaw zawiera również system wykrywania endogennej kontroli wewnętrznej (sonda genu kontroli wewnętrznej znakowana CY5) do monitorowania procesu pobierania próbek, amplifikacji RNA i PCR, zmniejszając w ten sposób wyniki fałszywie ujemne.
składniki | Tom(48T/zestaw) |
Roztwór reakcyjny RT-PCR | 96µl |
Mieszanka sond TaqMan startera nCOV (ORF1ab, gen N, gen RnaseP) | 864µl |
Negatywna kontrola | 1500 µl |
Kontrola pozytywna nCOV (1 gen ORF1ab N) | 1500 µl |
Odczynniki własne: odczynniki do ekstrakcji lub oczyszczania RNA.Kontrola negatywna/pozytywna: Kontrola pozytywna to RNA zawierający docelowy fragment, podczas gdy kontrola negatywna to woda wolna od kwasów nukleinowych.Podczas użytkowania powinny brać udział w ekstrakcji i powinny być uważane za zakaźne.Należy się z nimi obchodzić i utylizować zgodnie z obowiązującymi przepisami.
Wewnętrznym genem odniesienia jest ludzki gen RnaseP.
-20 ± 5 ℃, unikaj wielokrotnego zamrażania i rozmrażania więcej niż 5 razy, ważne przez 6 miesięcy.
Z FAM/HEX/CY5 i innym wielokanałowym fluorescencyjnym instrumentem PCR.
1. Odpowiednie rodzaje próbek: wymazy z gardła, wymazy z nosogardzieli, płyn do płukania oskrzelowo-pęcherzykowego, plwocina.
2. Pobieranie materiału (technika aseptyczna)
Wymaz z gardła: Przetrzyj migdałki i tylną ścianę gardła dwoma wymazówkami jednocześnie, a następnie zanurz końcówkę wymazówki w probówce zawierającej roztwór do pobierania próbek
Plwocina: gdy pacjent ma głęboki kaszel, zebrać odkrztuszoną plwocinę do zakręcanej probówki zawierającej roztwór do pobierania próbek;płyn do płukania oskrzelowo-pęcherzykowego: pobieranie próbek przez personel medyczny.3. Przechowywanie i transport próbek
Próbki do izolacji wirusa i badania RNA należy zbadać tak szybko, jak to możliwe.Próbki, które można wykryć w ciągu 24 godzin, można przechowywać w temperaturze 4 ℃;te, których nie można wykryć w ciągu 24
godziny należy przechowywać w temperaturze -70 ℃ lub niższej (jeśli nie ma warunków przechowywania -70 ℃, należy je
tymczasowo przechowywane w lodówce -20 ℃).Próbki należy unikać wielokrotnego zamrażania i rozmrażania podczas transportu.Próbki należy przesłać do laboratorium jak najszybciej po pobraniu.Jeśli próbki muszą być transportowane na duże odległości, zaleca się przechowywanie w suchym lodzie.
1 Przetwarzanie próbek i ekstrakcja RNA (obszar przetwarzania próbek)
Zaleca się pobranie 200 μl płynnej próbki do ekstrakcji RNA.Informacje na temat powiązanych etapów ekstrakcji można znaleźć w instrukcjach dostępnych w sprzedaży zestawów do ekstrakcji RNA.Zarówno negatywne, jak i negatywne
kontrole w tym zestawie były zaangażowane w ekstrakcję.
2 Przygotowanie odczynników do PCR (obszar przygotowania odczynników)
2.1 Wyjąć wszystkie elementy z zestawu, rozmrozić i wymieszać w temperaturze pokojowej.Wirować przy 8000 obr./min przez kilka sekund przed użyciem;obliczyć wymaganą ilość odczynników i przygotować układ reakcyjny zgodnie z poniższą tabelą:
składniki | Porcja N (system 25 µl) |
starter nCOV mieszanina sond TaqMan | 18 ul × N |
Roztwór reakcyjny RT-PCR | 2 ul × N |
*N = liczba badanych próbek + 1 (kontrola negatywna) + 1 (nCOVkontrola pozytywna) |
2.2 Po dokładnym wymieszaniu składników odwirować przez krótki czas, aby cały płyn ze ścianek probówki opadł na dno probówki, a następnie podzielić 20 µl systemu do amplifikacji na probówkę do PCR.
3 Pobieranie próbek (obszar przygotowania próbek)
Po ekstrakcji dodać po 5 μl kontroli negatywnej i pozytywnej.RNA badanej próbki dodaje się do probówki do reakcji PCR.
Zamknąć szczelnie probówkę i wirować przez kilka sekund przy 8000 obr./min przed przeniesieniem do obszaru wykrywania amplifikacji.
4 Amplifikacja PCR (wzmocniony obszar wykrywania)
4.1 Umieść probówkę reakcyjną w celi pomiarowej instrumentu i ustaw parametry w następujący sposób:
scena | Cykl numer | Temperatura(°C) | Czas | kolekcjastrona |
Odwracaćtranskrypcja | 1 | 42 | 10 minut | - |
Wstępna denaturacjan | 1 | 95 | 1 minuta | - |
Cykl | 45 | 95 | 15s | - |
60 | 30s | gromadzenie danych |
Wybór kanału wykrywania instrumentu: Wybierz kanał FAM, HEX, CY5 dla sygnału fluorescencji.Dla odniesienia fluorescencyjny BRAK, proszę nie wybierać ROX.
5 Analiza wyników (proszę zapoznać się z instrukcjami eksperymentalnymi każdego instrumentu w celu ustawienia)
Po reakcji zapisz wyniki.Po analizie dostosuj wartość początkową, końcową i wartość progową linii bazowej zgodnie z obrazem (użytkownik może dostosować się do rzeczywistej sytuacji, wartość początkową można ustawić na 3 ~ 15, wartość końcową można ustawić na 5~20, regulacja) na wykresie logarytmicznym Na progu okienka linia progowa jest w fazie logarytmicznej, a krzywa wzmocnienia kontroli ujemnej jest linią prostą lub poniżej linii progowej).
6 Kontrola jakości (Test obejmuje kontrolę proceduralną) Kontrola ujemna: Brak oczywistej krzywej amplifikacji dla kanałów detekcji FAM, HEX, CY5n
Kontrola pozytywna COV: oczywista krzywa amplifikacji kanałów detekcji FAM i HEX, wartość Ct ≤32, ale brak krzywej amplifikacji kanału CY5;
Powyższe wymagania muszą być spełnione jednocześnie w tym samym eksperymencie;w przeciwnym razie eksperyment jest nieważny i należy go powtórzyć.
7 Określenie wyników.
7.1 Jeśli w kanałach FAM i HEX badanej próbki nie ma krzywej amplifikacji lub wartości Ct > 40, a w kanale CY5 jest krzywa amplifikacji, można stwierdzić, że nie ma nowego koronawirusa 2019 (2019-nCoV) RNA w próbce;
.2 Jeśli badana próbka ma oczywiste krzywe amplifikacji w kanałach FAM i HEX, a wartość Ct wynosi ≤40, można stwierdzić, że próbka jest pozytywna w kierunku nowego koronawirusa 2019 (2019-nCoV).
7.3 Jeśli badana próbka ma wyraźną krzywą amplifikacji tylko w jednym kanale FAM lub HEX, a wartość Ct wynosi ≤40, aw drugim kanale nie ma krzywej amplifikacji, wyniki należy powtórzyć.Jeśli wyniki ponownego testu są spójne, próbka może być uznana za pozytywną dla nowego
koronawirus 2019 (2019-nCoV).Jeśli wynik ponownego testu jest negatywny, można stwierdzić, że próbka jest ujemna w kierunku nowego koronawirusa 2019 (2019-nCoV).
Metoda krzywej ROC służy do określenia referencyjnej wartości CT zestawu, a wartość referencyjna kontroli wewnętrznej wynosi 40.
1. Każdy eksperyment powinien być przetestowany pod kątem negatywnych i pozytywnych kontroli.Wyniki badań można określić tylko wtedy, gdy kontrole spełniają wymagania kontroli jakości
2. Gdy kanały detekcji FAM i HEX są dodatnie, wynik z kanału CY5 (wewnętrzny kanał kontrolny) może być ujemny z powodu konkurencji systemowej.
3.Gdy wynik kontroli wewnętrznej jest ujemny, jeżeli kanały detekcji FAM i HEX probówki również są ujemne, oznacza to, że system jest niesprawny lub działa nieprawidłowo, t test jest nieważny.Dlatego próbki muszą zostać ponownie przebadane.