Produkty
Zestaw do wykrywania SARS-Cov-2-RT-PCR Lifecosm dla 2019-nCoV
Oczekiwane użycie
Zestaw ten służy do jakościowego wykrywania nowego koronaawirusa (2019-nCoV) przy użyciu wymazów z gardła, wymazów z nosogardzieli, płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego i plwociny. Wynik wykrycia tego produktu służy wyłącznie do celów klinicznych i nie powinien być używany jako jedyny dowody na potrzeby diagnozy klinicznej i leczenia. Zaleca się wszechstronną analizę stanu w połączeniu z objawami klinicznymi pacjenta i innymi badaniami laboratoryjnymi.
Zasada inspekcji
Zestaw oparty jest na technologii jednoetapowego RT-PCR.W rzeczywistości geny ORF1ab i N nowego wirusa korony 2019 (2019-nCoV) wybrano jako regiony docelowe amplifikacji.Specyficzne startery i sondy fluorescencyjne (sondy genu N są znakowane FAM, a sondy ORF1ab znakowane HEX) są przeznaczone do wykrywania RNA nowego typu wirusa 2019 w próbkach.Zestaw zawiera także system detekcji endogennej kontroli wewnętrznej (sonda genu kontroli wewnętrznej znakowana CY5) umożliwiająca monitorowanie procesu pobierania próbek, amplifikacji RNA i PCR, redukując w ten sposób wyniki fałszywie ujemne.
Główne składniki
| składniki | Tom（48T/zestaw） |
| Roztwór reakcyjny RT-PCR | 96µl |
| Mieszanka sond TaqMan startera nCOV (ORF1ab, gen N, gen RnaseP) | 864µl |
| Negatywna kontrola | 1500µl |
| nCOV Kontrola pozytywna (gen l ORF1ab N) | 1500µl |
Odczynniki własne: odczynniki do ekstrakcji lub oczyszczania RNA.Kontrola negatywna/pozytywna: Kontrolą pozytywną jest RNA zawierający fragment docelowy, natomiast kontrolą ujemną jest woda wolna od kwasów nukleinowych.Podczas stosowania powinny brać udział w ekstrakcji i należy je uznać za zakaźne.Należy się z nimi obchodzić i utylizować zgodnie z obowiązującymi przepisami.
Wewnętrznym genem odniesienia jest ludzki gen RnaseP.
Warunki przechowywania i data ważności
-20 ± 5 ℃, unikać wielokrotnego zamrażania i rozmrażania więcej niż 5 razy, ważne przez 6 miesięcy.
Obowiązujący instrument
Z FAM/HEX/CY5 i innym wielokanałowym fluorescencyjnym instrumentem do PCR.
Wymagania dotyczące próbek
1. Obowiązujące rodzaje próbek: wymazy z gardła, wymazy z nosogardzieli, płyn z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego, plwocina.
2. Pobieranie próbek (technika aseptyczna)
Wymaz z gardła: Przetrzeć migdałki i tylną ścianę gardła dwoma gazikami jednocześnie, a następnie zanurzyć główkę wymazówki w probówce zawierającej roztwór do pobierania próbek
Plwocina: Po głębokim kaszlu pacjenta zebrać kaszlową plwocinę do probówki z zakrętką zawierającą roztwór do pobierania próbek;płyn do płukania oskrzelowo-pęcherzykowego: pobieranie próbek przez personel medyczny.3.Przechowywanie i transport próbek
Próbki do izolacji wirusa i badania RNA należy zbadać tak szybko, jak to możliwe.Próbki, które można wykryć w ciągu 24 godzin, można przechowywać w temperaturze 4°C;te, których nie można wykryć w ciągu 24 dni
godziny należy przechowywać w temperaturze -70°C lub niższej (jeśli nie ma warunków przechowywania wynoszących -70°C, należy je
tymczasowo przechowywane w lodówce -20℃).Próbki powinny unikać wielokrotnego zamrażania i rozmrażania podczas transportu.Próbki należy przesłać do laboratorium możliwie jak najszybciej po pobraniu.Jeżeli próbki muszą być transportowane na duże odległości, zaleca się przechowywanie w suchym lodzie.
Metody testowe
1 Przetwarzanie próbek i ekstrakcja RNA (obszar przetwarzania próbek)
Do ekstrakcji RNA zaleca się pobranie 200µl próbki płynnej.Informacje na temat powiązanych etapów ekstrakcji można znaleźć w instrukcjach dostępnych na rynku zestawów do ekstrakcji RNA.Zarówno te negatywne, jak i negatywne
kontrole w tym zestawie brały udział w ekstrakcji.
2 Przygotowanie odczynników do PCR (obszar przygotowania odczynników)
2.1 Wyjmij wszystkie elementy z zestawu, rozmroź i wymieszaj w temperaturze pokojowej.Przed użyciem odwiruj przy 8 000 obr./min przez kilka sekund;obliczyć wymaganą ilość odczynników i przygotować układ reakcyjny zgodnie z poniższą tabelą:
| składniki | Porcja N (system 25µl) |
| Mieszanka sond TaqMan ze starterem nCOV | 18 µl × N |
| Roztwór reakcyjny RT-PCR | 2 µl × N |
| *N = liczba badanych próbek + 1 (kontrola ujemna) + 1 (nCOVkontrola pozytywna) | |
2.2 Po dokładnym wymieszaniu składników, odwiruj przez krótki czas, aby cały płyn ze ścianek probówki opadł na dno probówki, a następnie podziel 20 µl systemu amplifikacji na porcje do probówki PCR.
3 Pobieranie próbek (obszar przygotowania próbek)
Po ekstrakcji dodać 5 µl kontroli negatywnej i pozytywnej.RNA badanej próbki dodaje się do probówki reakcyjnej PCR.
Szczelnie zamknij probówkę i wiruj przy 8000 obr./min przez kilka sekund przed przeniesieniem jej do obszaru wykrywania amplifikacji.
4 Amplifikacja PCR (wzmocniony obszar detekcji)
4.1 Umieść probówkę reakcyjną w kuwecie próbki urządzenia i ustaw parametry w następujący sposób:
| scena | Cykl numer | Temperatura(°C) | Czas | kolekcjastrona |
| Odwracaćtranskrypcja | 1 | 42 | 10 minut | - |
| Wstępna denaturacjan | 1 | 95 | 1 minuta | - |
| Cykl | 45 | 95 | 15s | - |
| 60 | lata 30 | zbieranie danych |
Wybór kanału detekcji instrumentu: Wybierz kanał FAM, HEX, CY5 dla sygnału fluorescencji.W przypadku odniesienia fluorescencyjnego BRAK, proszę nie wybierać ROX.
5 Analiza wyników (w celu ustawienia należy zapoznać się z instrukcją eksperymentalną każdego instrumentu)
Po reakcji zapisz wyniki.Po analizie dostosuj wartość początkową, końcową i wartość progową linii bazowej zgodnie z obrazem (użytkownik może dostosować w zależności od aktualnej sytuacji, wartość początkową można ustawić na 3 ~ 15, wartość końcową można ustawić na 5~20, regulacja) na wykresie logarytmicznym Na progu okna linia progowa znajduje się w fazie logarytmicznej, a krzywa wzmocnienia kontroli ujemnej jest linią prostą lub poniżej linii progowej).
6 Kontrola jakości (test obejmuje kontrolę proceduralną) Kontrola ujemna: Brak wyraźnej krzywej amplifikacji dla kanałów detekcyjnych FAM, HEX, CY5n
Kontrola pozytywna COV: wyraźna krzywa amplifikacji kanałów detekcyjnych FAM i HEX, wartość Ct ≤32, ale brak krzywej amplifikacji kanału CY5;
Powyższe wymagania muszą być spełnione jednocześnie w tym samym doświadczeniu;w przeciwnym razie eksperyment jest nieważny i należy go powtórzyć.
7 Określenie wyników.
7.1 Jeżeli w kanałach FAM i HEX badanej próbki nie ma krzywej amplifikacji lub wartości Ct > 40, a w kanale CY5 występuje krzywa amplifikacji, można ocenić, że nie ma nowego koronaawirusa 2019 (2019-nCoV) RNA w próbce;
.2 Jeżeli badana próbka ma wyraźne krzywe amplifikacji w kanałach FAM i HEX, a wartość Ct wynosi ≤40, można ocenić, że próbka jest pozytywna na obecność nowego koronaawirusa 2019 (2019-nCoV).
7.3 Jeżeli badana próbka ma wyraźną krzywą amplifikacji tylko w jednym kanale FAM lub HEX, a wartość Ct wynosi ≤40, a w drugim kanale nie ma krzywej amplifikacji, wyniki należy powtórzyć.Jeśli wyniki ponownego testu są spójne, można ocenić, że próbka dała wynik pozytywny w odniesieniu do nowej próbki
koronawirus 2019 (2019-nCoV).Jeżeli wynik ponownego testu będzie negatywny, można ocenić, że próbka jest ujemna na obecność nowego koronaawirusa 2019 (2019-nCoV).
Pozytywna wartość oceny
Do określenia wartości referencyjnej przekładnika prądowego zestawu stosuje się metodę krzywej ROC, a wartość referencyjna kontroli wewnętrznej wynosi 40.
Interpretacja wyników badań
1.Każdy eksperyment powinien zostać przetestowany pod kątem kontroli negatywnej i pozytywnej.Wyniki testów można określić tylko wtedy, gdy kontrole spełniają wymagania kontroli jakości
2. Gdy kanały detekcyjne FAM i HEX są dodatnie, wynik z kanału CY5 (wewnętrzny kanał kontrolny) może być ujemny ze względu na konkurencję systemu.
3. Jeżeli wynik kontroli wewnętrznej jest ujemny, jeżeli kanały detekcji FAM i HEX probówki są również ujemne, oznacza to, że system jest wyłączony lub nieprawidłowo wykonana, t test jest nieważny.Dlatego próbki należy zbadać ponownie.
