Produkty
Zestaw Lifecosm SARS-Cov-2-RT-PCR do wykrywania 2019-nCoV
Oczekiwane wykorzystanie
Zestaw służy do jakościowego wykrywania nowego koronawirusa (2019-nCoV) przy użyciu wymazów z gardła, wymazów z nosogardła, płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego i plwociny. Wynik wykrycia przy użyciu tego produktu służy wyłącznie celom klinicznym i nie powinien być wykorzystywany jako jedyny dowód klinicznej diagnozy i leczenia. Zaleca się kompleksową analizę stanu pacjenta w połączeniu z objawami klinicznymi i innymi badaniami laboratoryjnymi.
Zasada inspekcji
Zestaw opiera się na technologii RT-PCR w jednym kroku. W rzeczywistości geny ORF1ab i N nowego koronawirusa (2019-nCoV) 2019 zostały wybrane jako docelowe regiony amplifikacji. Specyficzne startery i sondy fluorescencyjne (sondy genu N są znakowane FAM, a sondy ORF1ab są znakowane HEX) są zaprojektowane w celu wykrywania RNA koronawirusa nowego typu 2019 w próbkach. Zestaw zawiera również endogenny system wykrywania kontroli wewnętrznej (sonda genu kontroli wewnętrznej znakowana CY5) w celu monitorowania procesu pobierania próbek, amplifikacji RNA i PCR, zmniejszając w ten sposób liczbę fałszywie ujemnych wyników.
Główne składniki
| Komponenty | Tom(48T/Zestaw） |
| Roztwór reakcyjny RT-PCR | 96 µl |
| Mieszanka sond TaqMan startera nCOV (ORF1ab, gen N, gen RnaseP) | 864 µl |
| Kontrola negatywna | 1500 µl |
| nCOV Kontrola pozytywna (gen l ORF1ab N) | 1500 µl |
Własne odczynniki: odczynniki do ekstrakcji lub oczyszczania RNA. Kontrola negatywna/pozytywna: kontrola pozytywna to RNA zawierające fragment docelowy, podczas gdy kontrola negatywna to woda wolna od kwasu nukleinowego. Podczas użytkowania powinny one uczestniczyć w ekstrakcji i powinny być uważane za zakaźne. Należy je obsługiwać i utylizować zgodnie z odpowiednimi przepisami.
Wewnętrznym genem referencyjnym jest ludzki gen RNazeP.
Warunki przechowywania i termin ważności
-20±5℃, nie zamrażać i rozmrażać więcej niż 5 razy, ważna przez 6 miesięcy.
Stosowany instrument
Z FAM / HEX / CY5 i innymi wielokanałowymi urządzeniami do fluorescencyjnego PCR.
Wymagania dotyczące próbek
1.Dopuszczalne rodzaje próbek: wymazy z gardła, wymazy z nosogardła, płyn z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego, plwocina.
2. Pobieranie próbek (technika aseptyczna)
Wymaz z gardła: Przetrzyj migdałki i tylną ścianę gardła dwoma wacikami jednocześnie, a następnie zanurz końcówkę wacika w probówce zawierającej roztwór do pobierania próbek
Plwocina: Po głębokim kaszlu pacjenta należy zebrać odkrztuszaną plwocinę do probówki z zakrętką zawierającej roztwór do pobierania próbek; płyn z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego: pobieranie próbek przez personel medyczny. 3. Przechowywanie i transport próbek
Próbki do izolacji wirusa i badania RNA należy testować tak szybko, jak to możliwe. Próbki, które można wykryć w ciągu 24 godzin, można przechowywać w temperaturze 4℃; te, których nie można wykryć w ciągu 24 godzin, należy przechowywać w temperaturze 4℃.
godziny powinny być przechowywane w temperaturze -70℃ lub niższej (jeśli warunki przechowywania nie wynoszą -70℃, należy je przechowywać
tymczasowo przechowywane w lodówce w temperaturze -20℃). Próbki należy unikać wielokrotnego zamrażania i rozmrażania podczas transportu. Próbki należy wysłać do laboratorium tak szybko, jak to możliwe po pobraniu. Jeśli próbki muszą być transportowane na duże odległości, zaleca się przechowywanie w suchym lodzie.
Metody testowe
1 Przetwarzanie próbek i ekstrakcja RNA (obszar przetwarzania próbek)
Zaleca się pobranie 200 μl próbki cieczy do ekstrakcji RNA. W celu uzyskania informacji na temat powiązanych kroków ekstrakcji należy zapoznać się z instrukcjami komercyjnych zestawów do ekstrakcji RNA. Zarówno negatywna, jak i negatywna
kontrole w tym zestawie były zaangażowane w ekstrakcję.
2 Przygotowanie odczynników PCR (obszar przygotowania odczynników)
2.1 Wyjmij wszystkie komponenty z zestawu, rozmroź i wymieszaj w temperaturze pokojowej. Przed użyciem odwiruj przy 8000 obr./min przez kilka sekund; oblicz wymaganą ilość odczynników, a układ reakcji przygotuj tak, jak pokazano w poniższej tabeli:
| Komponenty | Porcja N (system 25 µl) |
| Mieszanka sond TaqMan ze starterem nCOV | 18 µl × N |
| Roztwór reakcyjny RT-PCR | 2 µl × N |
| *N = liczba przebadanych próbek + 1 (kontrola negatywna) + 1 (nCOVkontrola pozytywna) | |
2.2 Po dokładnym wymieszaniu składników należy odwirować je przez krótki czas, aby cały płyn znajdujący się na ściance probówki opadł na jej dno, a następnie przenieść 20 µl roztworu amplifikacyjnego do probówki PCR.
3 Pobieranie próbek (obszar przygotowania próbek)
Dodaj 5 μl kontroli negatywnej i pozytywnej po ekstrakcji. RNA próbki do badania dodaje się do probówki reakcyjnej PCR.
Zamknij szczelnie probówkę i odwiruj ją przez kilka sekund przy 8000 obr./min, zanim przeniesiesz ją do obszaru wykrywania wzmocnienia.
4 Amplifikacja PCR (wzmocniony obszar wykrywania)
4.1 Umieść probówkę reakcyjną w celi pomiarowej urządzenia i ustaw parametry w następujący sposób:
| scena | Cykl numer | Temperatura(°C) | Czas | kolekcjastrona |
| Odwracaćtranskrypcja | 1 | 42 | 10 minut | - |
| Predenaturacjan | 1 | 95 | 1 minuta | - |
| Cykl | 45 | 95 | 15 sekund | - |
| 60 | 30s | zbieranie danych |
Wybór kanału detekcji instrumentu: Wybierz kanał FAM、HEX、CY5 dla sygnału fluorescencji. Dla odniesienia fluorescencja NONE, proszę nie wybierać ROX.
5. Analiza wyników (W celu uzyskania informacji na temat ustawień należy zapoznać się z instrukcjami eksperymentalnymi każdego urządzenia)
Po reakcji zapisz wyniki. Po analizie dostosuj wartość początkową, wartość końcową i wartość progową linii bazowej zgodnie z obrazem (użytkownik może dostosować zgodnie z rzeczywistą sytuacją, wartość początkową można ustawić na 3~15, wartość końcową można ustawić na 5~20, dostosowanie) na wykresie logarytmicznym. Na progu okna linia progowa znajduje się w fazie logarytmicznej, a krzywa wzmocnienia kontroli negatywnej jest linią prostą lub poniżej linii progowej).
6 Kontrola jakości (w teście uwzględniono kontrolę proceduralną) Kontrola negatywna: Brak wyraźnej krzywej wzmocnienia dla kanałów detekcji FAM, HEX, CY5
Kontrola pozytywna COV: wyraźna krzywa amplifikacji kanałów detekcyjnych FAM i HEX, wartość Ct ≤32, ale brak krzywej amplifikacji kanału CY5;
Powyższe wymagania muszą być spełnione jednocześnie w ramach tego samego eksperymentu; w przeciwnym razie eksperyment będzie nieważny i konieczne będzie jego powtórzenie.
7 Określenie wyników.
7.1 Jeżeli w kanałach FAM i HEX próbki testowej nie ma krzywej amplifikacji lub wartość Ct > 40, a w kanale CY5 występuje krzywa amplifikacji, można stwierdzić, że w próbce nie ma RNA nowego koronawirusa 2019 (2019-nCoV);
.2 Jeżeli próbka testowa ma wyraźne krzywe amplifikacji w kanałach FAM i HEX, a wartość Ct wynosi ≤40, można uznać, że próbka jest dodatnia pod względem obecności nowego koronawirusa 2019 (2019-nCoV).
7.3 Jeśli próbka testowa ma wyraźną krzywą wzmocnienia tylko w jednym kanale FAM lub HEX, a wartość Ct wynosi ≤40, a w drugim kanale nie ma krzywej wzmocnienia, wyniki należy ponownie przetestować. Jeśli wyniki ponownego testu są spójne, próbkę można uznać za pozytywną dla nowego
koronawirus 2019 (2019-nCoV). Jeśli wynik ponownego testu jest ujemny, można uznać, że próbka jest ujemna pod kątem nowego koronawirusa 2019 (2019-nCoV).
Wartość osądu pozytywnego
Do określenia wartości referencyjnej CT zestawu stosuje się metodę krzywej ROC, a wartość referencyjna kontroli wewnętrznej wynosi 40.
Interpretacja wyników testów
1. Każdy eksperyment powinien zostać przetestowany pod kątem kontroli negatywnych i pozytywnych. Wyniki testów można określić tylko wtedy, gdy kontrole spełniają wymagania kontroli jakości.
2. Jeśli kanały detekcji FAM i HEX są dodatnie, wynik z kanału CY5 (kanał sterowania wewnętrznego) może być ujemny ze względu na konkurencję systemową.
3. Jeśli wynik kontroli wewnętrznej jest negatywny, a kanały detekcji FAM i HEX probówki są również negatywne, oznacza to, że system jest wyłączony lub działanie jest nieprawidłowe, test jest nieważny. Dlatego próbki muszą zostać ponownie przetestowane.
